空間轉(zhuǎn)錄組測序或?qū)⒊上乱粋€熱點？10x Genomics已斥巨資壟斷行業(yè)

2016年，來自瑞典卡羅琳斯卡研究所、瑞典皇家理工學(xué)院等研究機構(gòu)的學(xué)者們在《Science》上發(fā)文，闡述了一種新的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究技術(shù)，并提出了“空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)”的概念。雖然他們并不是第一個嘗試將轉(zhuǎn)錄組測序與空間位置之間實現(xiàn)一一對應(yīng)的團(tuán)隊，但是他們給出的解決方案確實是最完善，最接近商業(yè)化的。

這項技術(shù)當(dāng)時并沒有造成巨大的轟動，但總有會慧眼識英的企業(yè)，比如10x Genomics。2018年底10x Genomics將這項技術(shù)收入囊中，并在一年的完善和優(yōu)化后將其推向市場。

如今的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)像極了當(dāng)年的單細(xì)胞測序，雖然還處在科研階段，但是已經(jīng)可以展望到其未來的發(fā)展空間。我們現(xiàn)在已經(jīng)看到了單細(xì)胞測序技術(shù)逐漸從完成概念驗證進(jìn)入臨床場景，而空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)很有可能會成為單細(xì)胞測序之后，又一個閃閃發(fā)光的測序技術(shù)外延領(lǐng)域。

通常進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序過程，是將一群細(xì)胞的RNA提取建庫進(jìn)行測序。這種方法在細(xì)胞成分單一的情況下有比較高的指導(dǎo)意義，但是當(dāng)細(xì)胞成分復(fù)雜，比如檢測組織樣本時，RNA建庫的過程導(dǎo)致所有細(xì)胞的RNA被混在一起檢測，互相干擾，最終的檢測結(jié)果只能輸出整個細(xì)胞群的平均值，數(shù)據(jù)的精細(xì)度大幅降低。與此同時，細(xì)胞的定位信息也在建庫的過程中丟失，而實際上，位置背景對于了解組織功能和病歷變化至關(guān)重要。

隨后出現(xiàn)的單細(xì)胞測序一定程度上解決了互相干擾的問題。不同類型的細(xì)胞可以被單獨篩選，然后各自建庫，進(jìn)行單細(xì)胞測序。但是篩選過程需要將細(xì)胞打散，所以位置信息還是無法被完整保留。

芯片上的捕獲引物結(jié)構(gòu)

Spatial的空間轉(zhuǎn)錄組測序原理

空間轉(zhuǎn)錄組測序的關(guān)鍵就在于，解決了空間位置保留的問題。

被放置在芯片區(qū)域內(nèi)的冰凍組織切片在經(jīng)過H&E染色和成像記錄后，會被進(jìn)行透化處理，釋放細(xì)胞中的RNA。芯片上的捕獲引物的中段設(shè)置了帶有獨特標(biāo)識的條形碼區(qū)域。芯片被劃分為了數(shù)個不同的捕獲區(qū)域，每個捕獲區(qū)域中錨定的引物都帶有不同的條形碼序列。每個區(qū)域?qū)?yīng)的組織位置會被記錄下來，然后再進(jìn)行測序后，通過條形碼將不同區(qū)域的測序結(jié)果，映射到對應(yīng)的組織位置上，最終拼貼形成組織樣品的空間轉(zhuǎn)錄組圖像。

相比于常規(guī)的測序手段，空間轉(zhuǎn)錄組測序有幾個明顯的優(yōu)勢：

1.將轉(zhuǎn)錄組信息與空間信息對應(yīng)，體現(xiàn)組織內(nèi)部的異質(zhì)性：每個區(qū)域獨特的條形碼使測序結(jié)果與空間位置形成一一對應(yīng)關(guān)系。雖然暫時還無法精細(xì)到單細(xì)胞層面，但是這樣的區(qū)域劃分也已經(jīng)足以展現(xiàn)出組織內(nèi)部不同區(qū)域間的轉(zhuǎn)錄組差異。

2.不影響對全組織進(jìn)行全面分析：芯片上捕獲的全轉(zhuǎn)錄組在同一個反應(yīng)中完成測序，能有效降低多次重復(fù)實驗中的誤差。測序結(jié)果如果不按照條形碼歸類，則直接體現(xiàn)的是切片全組織的轉(zhuǎn)錄組情況，無需再做單獨檢測。

3.為進(jìn)一步的研究提供指導(dǎo)意見：常規(guī)的轉(zhuǎn)錄組測序，對后續(xù)實驗的指導(dǎo)仍然停留在全組織層面。而空間轉(zhuǎn)錄組測序則可以標(biāo)識出更有價值的研究區(qū)域，引導(dǎo)研究者將組織進(jìn)一步細(xì)分。

完成了空間轉(zhuǎn)錄組測序的基礎(chǔ)研究之后，研究者們迅速創(chuàng)立了一家企業(yè)，開始嘗試將這一技術(shù)量產(chǎn)化。這家企業(yè)的名字定名為Spatial Transcriptomics，也就是空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)，可謂是非常簡單粗暴了。

這家公司成立之后非常低調(diào)，直到被10x Genomics收購，沒有進(jìn)行過企業(yè)的宣傳，也沒有任何融資經(jīng)歷，創(chuàng)始人、發(fā)展情況，都一概不知。因此在分析行業(yè)之余，也不得不承認(rèn)10x Genomics的挖掘能力，能夠從眾多Biotech企業(yè)中挖掘出Spatial這支來自瑞典的潛力股。

2018年12月，10x Genomics公司宣布，已收購位于瑞典的空間基因組學(xué)技術(shù)開發(fā)商Spatial Transcriptomics。此時代表Spatial Transcriptomics發(fā)言的聯(lián)合創(chuàng)始人Joakim Lundeberg，正是那篇發(fā)表在《Science》的文章的通訊作者之一。對于本次收購，10x Genomics和Spatial雙方都認(rèn)為，Spatial提供的技術(shù)基礎(chǔ)揭示了細(xì)胞間的互相作用，幫助研究者們更加接近生物學(xué)的全貌。

Visium平臺示例

被10x Genomics收購之后，Spatial的技術(shù)平臺被更名為Visium，在10x Genomics內(nèi)部繼續(xù)孵化。最初，10x Genomics并未公布這次收購的具體細(xì)節(jié)。直到2019年8月，10x Genomics遞交招股書，準(zhǔn)備在納斯達(dá)克上市，這一交易的部分細(xì)節(jié)才在招股書中公開。

根據(jù)招股書中的信息，10x Genomics以3860萬美元收購了Spatial，并獲得了Spatial相關(guān)的一系列專利、商標(biāo)和客戶關(guān)系。其中僅專利的價值就達(dá)到了3690萬美元，而其余的有形資產(chǎn)和無形資產(chǎn)總價值僅約166萬美元。

到2019年12月，10x Genomics宣布收購Spatial一年之際，Visium平臺正式推出，成為了第一款走入商業(yè)化進(jìn)程的空間轉(zhuǎn)錄組產(chǎn)品。

在2020年初的AGBT（基因組技術(shù)和生物進(jìn)展）會議上，10x Genomics表示未來將進(jìn)一步提高Visium的兼容性，尤其是在測序的同時允許用戶在同一樣本上測定蛋白和基因表達(dá)，以及對于FFPE（福爾馬林固定石蠟包埋）樣品的兼容。這些新功能都將顯著提升Visium平臺的應(yīng)用范圍。

就在10x Genomics興奮的規(guī)劃自己的前路時，剛剛進(jìn)入市場兩個月的Visium受到了后來者的挑戰(zhàn)。就在本次AGBT大會上，ReadCoor也推出了自己的空間轉(zhuǎn)錄組測序產(chǎn)品RC2。

ReadCoor的技術(shù)基礎(chǔ)源于遺傳學(xué)泰斗George Church團(tuán)隊發(fā)明的FISSEQ原位測序方法。這一技術(shù)發(fā)明的時間更早，早在2014年George Church團(tuán)隊就在《Science》上發(fā)表了相關(guān)的文章，并隨后在《Nature Protocols》上公布了FISSEQ的詳細(xì)步驟。

以這一技術(shù)為基礎(chǔ)的ReadCoor，自然受到了一級市場的青睞。A輪融資就獲得了禮來亞洲、維梧資本、德誠資本等知名投資機構(gòu)參與，融資額達(dá)到2300萬美元。經(jīng)過幾年的潛心研發(fā)，ReadCoor在2020年的AGBT大會上正式推出了自己的空間轉(zhuǎn)錄組測序平臺RC2。在產(chǎn)品發(fā)布前夕還收獲了蘭亭投資領(lǐng)投的2700萬美元B輪融資。

Readcoor的測序平臺RC2

ReadCoor使用的核心技術(shù)FISSEQ是一種熒光原位測序技術(shù)。RNA本身很小，直接對組織中的RNA進(jìn)行測序難度很高。因此FISSEQ在樣品制備的過程中會先將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并接成環(huán)狀，然后使用特定的DNA聚合酶（如Φ29）進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增（RCA），形成體積較大的擴(kuò)增子。所有形成的擴(kuò)增子會被相互交聯(lián)，以保證其空間位置不會在測序過程中發(fā)生移動。這樣一來，在測序的每一個循環(huán)中對切片進(jìn)行掃描，就可以將擴(kuò)增子的序列信息與空間位置相結(jié)合，達(dá)到空間轉(zhuǎn)錄組測序的目的。

相比于Vissium，RC2是個一站式的解決方案，真正將分辨率控制到單個細(xì)胞，并且除了RNA層面的轉(zhuǎn)錄組研究，其檢測的范圍還涵蓋蛋白質(zhì)和DNA，實現(xiàn)多組學(xué)同時檢測。但RC2的缺點也非常明顯，首先整套系統(tǒng)價格昂貴，一臺機器要40萬美元，而且由于高精度的切片掃描需要大量的時間，因此這臺機器的通量非常小，單次分析短則一天，多則數(shù)日，并且最多同時分析四個樣本。這樣的通量規(guī)模勉強滿足科研需求，很難形成規(guī)模化的產(chǎn)業(yè)。

如果拋開可用性不談，RC2在檢測精度上明顯高于Vissium。盡管缺點也十分明顯的，由于這一技術(shù)還處于起步階段，RC2仍然毫無疑問的成為了Vissium最大的潛在競爭對手。

更重要的是，RC2目前已經(jīng)可以支持FFPE樣品的檢測，但是10x Genomics的解決方案還僅支持冰凍切片。對于更廣泛的科研和臨床市場來說，F(xiàn)FPE樣品的存量更大，應(yīng)用范圍也更廣，顯然代表著更大規(guī)模的市場。

在這一系列原因的推動下，10x Genomics最終決定斥巨資將ReadCoor，這個最大的威脅轉(zhuǎn)化成伙伴。并且RC2與Vissium之間的技術(shù)路線有可能會形成互補，將二者的優(yōu)勢結(jié)合，形成一款檢測精度高，并且可用性強的產(chǎn)品。

鎖式探針

10x Genomics的競爭對手還不止ReadCoor一家。另一家公司Cartana也在做類似的產(chǎn)品，使用的方法與Visium和RC2都有些關(guān)聯(lián)。Cartana使用特異性的鎖式探針在直鏈cDNA上實現(xiàn)了滾環(huán)擴(kuò)增。引物上的條形碼區(qū)域可以保證擴(kuò)增產(chǎn)物的空間定位準(zhǔn)確。但是這項技術(shù)目前還無法實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄組測序，只能根據(jù)研究方向設(shè)計專門的引物。但是這一方法仍然為Visium平臺的發(fā)展帶來了潛在的競爭壓力，10x Genomics也迅速的捕捉到了這一點。

如今這兩個競爭對手已經(jīng)盡數(shù)被10x Genomics收入囊中。2020年10月5日，10x Genomics宣布，將以3.5億美元收購空間多組學(xué)平臺ReadCoor，同時還表示自己已經(jīng)在8月以4500萬美元收購了RNA分析技術(shù)研發(fā)企業(yè)Cartana。接連兩項大額收購，表明10x Genomics已經(jīng)下定決心，要在空間轉(zhuǎn)錄組測序方面走的更遠(yuǎn)。

完成了對ReadCoor和Cartana的收購后，10x Genomics在空間轉(zhuǎn)錄組測序市場上，幾乎已經(jīng)沒有了對手。如今Visium已經(jīng)投入市場近一年，國內(nèi)很多科研解決方案提供商都已經(jīng)上線了空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究服務(wù)。

在科研服務(wù)市場上，貝瑞基因、諾禾致源、百邁客、伯豪生物等企業(yè)都相繼推出了自己的空間轉(zhuǎn)錄組測序服務(wù)。從我們目前采集到的信息看，整體市場處于供不應(yīng)求的狀態(tài)。無論是好奇心驅(qū)動，還是確實對研究有重大意義，科研市場對于這一新技術(shù)表現(xiàn)出了濃厚的興趣。

 “其實從2019年初，科研市場就已經(jīng)開始對空間轉(zhuǎn)錄組這一技術(shù)進(jìn)行相關(guān)的宣傳了。大家都覺得這個技術(shù)是繼單細(xì)胞測序之后，基因測序領(lǐng)域的又一重大突破。”諾禾致源的空間轉(zhuǎn)錄組業(yè)務(wù)負(fù)責(zé)人劉國靜介紹到。

“主要的應(yīng)用層面還是在科研上，患者樣品、模式動物樣品，現(xiàn)在還發(fā)展到植物的樣品，都可以做?！?span style="margin: 0px; padding: 0px; color: rgb(255, 129, 36);">百邁客醫(yī)學(xué)業(yè)務(wù)單元總經(jīng)理劉敏告訴我們。

Visium主要解決的是轉(zhuǎn)錄組，也就是mRNA層面的問題。上一級的基因組，和下一級的蛋白組，目前為止已經(jīng)有比較明確的解決方案了。細(xì)胞的基因組一般來說區(qū)別不大，因此全基因組測序，或者外顯子組測序，已經(jīng)組以解決基因組層面的問題，不必要考慮空間信息。而蛋白組層面，免疫組化可以實現(xiàn)蛋白組層面的檢測，但是檢測效率有限，一般一張切片只能檢測一個蛋白靶標(biāo)，而且檢測不同的蛋白需要用特異性的一抗。

由于轉(zhuǎn)錄組和蛋白表達(dá)之間的相關(guān)性，高通量的空間轉(zhuǎn)錄組測序可以為進(jìn)一步的蛋白組檢測提供指導(dǎo)意見，幫助研究人員從大量的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中尋找更可能有價值的蛋白marker。

目前這一產(chǎn)品的定價還比較高，從我們調(diào)研的幾家信息來看，單個樣品的檢測價格在4-5萬，包括了從樣品制備到最終數(shù)據(jù)分析的全流程。這一高價狀態(tài)與檢測儀器的成本、試劑耗材成本、還有復(fù)雜的樣品制備過程都有關(guān)系。但是隨著技術(shù)的革新和方法上的不斷改進(jìn)，相信這一技術(shù)最終會像NGS一樣，成為能夠廣泛應(yīng)用的產(chǎn)品類型。

“從我們現(xiàn)在看來，這一產(chǎn)品的降價空間還是比較大的，未來的發(fā)展空間也很廣闊。Visium現(xiàn)在的功能還僅限于轉(zhuǎn)錄組，未來如果能擴(kuò)展到甲基化，或是其他一些影響基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的檢測靶標(biāo)上，平臺的價值會大幅提升?！眲⒚粽f。

當(dāng)然在廣泛應(yīng)用之前，Visium也還有很多問題需要克服。

“這個產(chǎn)品用在科研領(lǐng)域，技術(shù)上已經(jīng)相對成熟了，操作難度也不是太高。但是第一，分辨率還有待提升，比如如果能做到單細(xì)胞級別，甚至更高的分辨率，就能滿足更高層面上的需求；第二未來這個產(chǎn)品想要廣泛應(yīng)用，肯定不能只限于冰凍切片，F(xiàn)FPE樣品的檢測是一定要克服的。”劉國靜說。

劉國靜談到的兩個問題，10x Genomics已經(jīng)在著手解決了。FFPE樣品分析預(yù)計在2021年上半年推出。精度方面，Visium已經(jīng)在Spatial的技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)生了明顯的提升，從1000多個點上升到了4992個點，未來顯然還會繼續(xù)提升。

對于更深層次的臨床應(yīng)用，劉敏認(rèn)為不可操之過急：“從長遠(yuǎn)的角度上看，在臨床上的應(yīng)用肯定是非常有前景的，但可能還需要很長的時間。不止是因為精度和成本方面還達(dá)不到進(jìn)入臨床的水平，更重要的是，臨床上現(xiàn)在對于轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)積累和研究認(rèn)知還不夠充分。所以價值肯定有，但是短期內(nèi)很難走到臨床層面?！?/p>

隨著二代測序技術(shù)的發(fā)展成熟，尤其是在成本大幅降低之后，二代測序近兩年隱隱有取代PCR、FISH等常規(guī)基因檢測技術(shù)的趨勢。比如在今年的新冠肺炎檢測是試劑盒中，華大基因開發(fā)的宏基因組測序檢測試劑盒是最早一批獲批上市的檢測產(chǎn)品之一。

但是另一方面，雖然測序技術(shù)已經(jīng)趨于完善，但其在臨床上的應(yīng)用場景挖掘卻還不夠深入。目前臨床上最直接的應(yīng)用場景就是腫瘤伴隨診斷和宏基因組檢測兩大方向，檢測目標(biāo)主要圍繞著基因組展開，小到幾個基因的panel，大到全外顯子檢測。但這些畢竟只是基因組層面的信息，需要經(jīng)過轉(zhuǎn)錄-翻譯的過程，才能最終體現(xiàn)在腫瘤的表型上。而在轉(zhuǎn)錄-翻譯的過程中，復(fù)雜的調(diào)控機制帶來的腫瘤異質(zhì)性，基因組測序更加無從得知。

空間轉(zhuǎn)錄組測序的出現(xiàn)為基因測序領(lǐng)域帶來了新的機會。無論是對于上游的測序儀行業(yè)，還是未來為應(yīng)用層帶來的可能性，空間轉(zhuǎn)錄組測序都是個值得基因檢測行業(yè)重點考慮的新方向。

在科研行業(yè)中，針對轉(zhuǎn)錄組的大規(guī)模研究，研究方法主要以PCR-array為主。PCR-array本質(zhì)上是通過芯片實現(xiàn)的高通量Real-time PCR過程，根據(jù)研究者的需求，可以對要檢測的目標(biāo)基因進(jìn)行不同panel大小的定制。這種方法在體外培養(yǎng)的細(xì)胞樣品分析上，可以達(dá)到比較好的效果，但是當(dāng)上升到組織層面，PCR-array無法很好的區(qū)分組織的異質(zhì)性，只能實現(xiàn)混合物的統(tǒng)一分析。

空間轉(zhuǎn)錄組測序可以比PCR-array更好的滿足科研方面的需求。使用PCR-array的場景往往在于從大量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中挖掘潛在的可能性。相比于研究體外樣品，組織樣品更加貼近機體的自然裝填，顯然具有比體外樣品更高的價值。而且空間轉(zhuǎn)錄組測序還能從空間維度區(qū)分組織內(nèi)部的異質(zhì)性，為研究者提供更深度的研究價值。

此前我們在測序儀行業(yè)的分析中就談到過，目前Illumina在全球測序儀市場上已經(jīng)接近壟斷地位。未來國產(chǎn)測序儀如果想要突圍，與應(yīng)用層合作落地可能是最好的市場拓展選項之一。切到具體應(yīng)用場景的產(chǎn)品，往往本身并不附帶測序功能，比如單細(xì)胞測序、腫瘤伴隨診斷等。如果能與這些檢測產(chǎn)品合作落地，形成一整套完整的分析體系，就可以為使用者提供一整套完整的工作流程。

這一點對于空間轉(zhuǎn)錄組測序產(chǎn)業(yè)也是一樣的。以Visium為例，Visium本身提供的主要是針對樣品的處理方案，包括組織優(yōu)化試劑盒和空間基因表達(dá)試劑盒。而后續(xù)的測序環(huán)節(jié)，則由用戶自己選擇。如果國產(chǎn)測序儀行業(yè)能夠針對空間轉(zhuǎn)錄組測序進(jìn)行針對性的優(yōu)化，甚至直接整合成一整套自動化的處理系統(tǒng)，可能有機會搶占這一部分市場份額。

雖然如今談及應(yīng)用層面還為時尚早，但是空間轉(zhuǎn)錄組測序為組織內(nèi)細(xì)胞的細(xì)分亞型和空間分布給出了新的分析維度，可能會幫助臨床實現(xiàn)更好的患者分子分型。尤其對于Biomarker的挖掘方面，多組學(xué)分析中如果可以新增這兩個重要的維度，對于藥物有效群體的挖掘?qū)黻P(guān)鍵性的指導(dǎo)意義。

劉國靜告訴我們，他們已經(jīng)在實際的工作中接觸過一些藥企了：“有些藥企其實已經(jīng)向我們表達(dá)過了對這個新技術(shù)的興趣，但是具體的合作目前都還在洽談中。他們的訴求是希望能夠通過這項新技術(shù)提供的新維度，看能不能發(fā)現(xiàn)一些新的標(biāo)志物，新的功能細(xì)胞群體、新的細(xì)胞通訊方式等，能夠在研發(fā)環(huán)節(jié)上幫助到他們。”

新的技術(shù)總會帶來新的機會和新的市場。雖然空間轉(zhuǎn)錄組測序目前為止商業(yè)化才剛剛一年，但是我們已經(jīng)可以看到這項技術(shù)未來在臨床上應(yīng)用的價值。經(jīng)過先后幾次收購，10x Genomics暫時實現(xiàn)了對這一領(lǐng)域的全面掌控，當(dāng)然我們也希望這一次國內(nèi)的技術(shù)平臺能夠更快速的跟進(jìn)項目，實現(xiàn)這一領(lǐng)域的全面突破。